Biolog微生物鑒定步驟
一 檢測原理

Biolog微生物鑒定系統測試的是微生物在鑒定板中利用或氧化化和物的能力。測試會產生特征性的紫色孔模式，組成代謝指紋。所有必需的營養物質和生化試劑都預先加進96孔板中，四唑紫是一種氧化還原染料，指示碳源的利用情況。.鑒定步驟非常簡單，純化分離到的菌株經擴大培養，再制成接種液加到鑒定板中。在培養過程中，一些孔中的化學物質能被氧化并將顯色物質成紫色，對照孔（A-1）和陰性孔仍然為無色。鑒定板在相應的培養條件下培養4-6小時或16-24小時即可形成代謝模式。系統軟件自動和數據庫對比，如果能找到合適的匹配，就可以得出一個鑒定結果。

二 所需器材和消耗品：

?培養基、接種液、巰基乙酸鈉、長棉簽、接種棒、儲液槽、八道移液器、移液器頭、濁度儀、濁度標準品、控溫培養箱和相應的鑒定板。其中接種液自行配制，接種棒、儲液槽可選用國產品牌代替。

三 鑒定步驟：

Biolog微生物鑒定樣品處理步驟
分離純化培養基
BUG+B
通用培養基加羊血
BUA+B
厭氧培養基加羊血
BUY
酵母培養基
2%ME
2%的麥芽汁提取物

革蘭氏染色和菌落菌株形態觀察
革蘭氏染色結果
革蘭氏陰性
革蘭氏陽性
厭氧菌
酵母菌
絲狀真菌
確認實驗
氧化酶反應陽性
氧化酶反應陰性、三糖鐵實驗A/A或K/A
需在巧克力培養基上或需要6.5% CO2培養

確認實驗
氧化酶反應陰性、三糖鐵實驗K/K或K/Aw
微生物類型
GN-NENT
非腸道菌
GN-ENT
腸道菌
GN-FAS
苛生菌
GP-COCCUS-ROD桿球菌、GP-COCCUS球菌、GP-ROD桿菌
GP-ROD
（芽孢桿菌）
AN
厭氧菌
YT
酵母菌
FF
絲狀真菌
擴大培養基
BUG+B
BUG+B
巧克力培養基
BUG+B
BUG+M+T
BUA+B
BUY
2%ME
培養溫度
30℃
35-37℃
35-37℃
35-37℃
30℃
35-37℃
26℃
26℃
培養氣體
空氣
空氣
6.5% CO2
空氣或6.5% CO2
空氣
無氫氣的厭氧環境
空氣
空氣
接種液類型
GN/GP-IF
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF+T
GN/GP-IF
AN-IF
水
FF-IF
接種濁度/
濁度標準管
52%T
GN-NENT
61%T
GN-ENT
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
20%T
GP-COC&GP-ROD&GN-FAS
28%T
GP-ROD SB
65%T
AN
47%T
YT
75%T
FF
鑒定板類型/
每孔菌懸液的量
GN2
150μl
GN2
150μl
GN2
150μl
GP2
150μl
GP2
150μl
AN
100μl
YT
100μl
FF
100μl
培養時間（小時）
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
4-6,16-24
20-24
24,48,72
24,48,72,96

第一步：
在用戶自己的培養基上純化菌株，如果菌株為凍干或冷凍樣品，需要傳代培養2-3代，讓菌株恢復活力。
對純化好的菌株做革蘭氏染色，確定菌株是革蘭氏陰性還是陽性。觀察菌落外部形態或用顯微鏡觀察菌株形態，確定是酵母還是絲狀真菌，是球菌還是桿菌。
如果是革蘭氏陰性菌，還需要最終確認是腸道菌、非腸道菌或苛生菌。方法是，氧化酶陽性或氧化酶陰性但三糖鐵實驗為K/K或K/Aw，則該菌株為非腸道菌(GN-NENT)，氧化酶陰性以及三糖鐵實驗為A/A或K/A，則該菌株為腸道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培養基上或需要6.5% CO2培養，②在BUG+B培養基上生長非常差，形成針尖大小的菌落，那么可以認為這些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多數苛生菌都是從哺乳動物的呼吸道里分離出來的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。
如果是革蘭氏陽性菌，用革蘭氏染色可以很容易的區分球菌和桿菌，推薦再做一個過氧化氫酶實驗，最終確定是球菌還是桿菌。通過革蘭氏染色或觀察菌落形態可以區分出芽孢桿菌。
微生物的擴大培養應該用Biolog推薦的培養基和培養條件，以便使微生物達到最佳的代謝活性，進而準確的和數據庫中的代謝模式匹配。
微生物應該是新鮮的，確保其處于指數增長期，因為一些菌株在達到穩定期時會失去生存能力或代謝活性，推薦的培養周期為4-24個小時。
如果擴大培養的量不足以配制相應的濁度，可以培養多個平板，培養時間可以延長到48個小時。
第二步：
首先確定濁度儀沒開啟電源的時候，指針應指在0%，如果沒有，用螺絲刀調整。開啟電源，取未開蓋的裝有接種液的試管，擦干凈管壁，放入濁度儀，指針應指在100%，如果沒有，旋動右方旋鈕?。然后用濁度標準管檢驗，讀數在±2%都是正常的。要使用哪管接種液，就用相應的試管做100%校正，不要在濁度儀的光路中旋轉試管。
? 在鑒定革蘭氏陰性腸道菌和苛生菌的時候，在接種液里應該加準確三滴巰基乙酸鈉。巰基乙酸鈉的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖莢膜而出現的紫色。一些非腸道菌液需要添加巰基乙酸鈉。
按照下列步驟制備均勻的菌懸液：用接種液將棉簽稍微浸濕，用棉簽在菌落上面輕輕的滾動可以將菌落取到接種液中，從而不會將培養基或其它營養物質帶入接種液。先取單菌落，不夠再取生長緊密的菌落。在試管內壁接種液液面的上方，旋轉擠壓棉簽可以將菌落團分散。然后上下移動棉簽，將分散的菌落和接種液充分混合形成均一，無菌團的菌懸液。如果菌懸液有菌團，可以讓菌團沉到管底。
?? 調整濁度直至達到允許的范圍，增加接種液或添加菌落可以降低或升高菌懸液的密度。
?? 將菌懸液接種到鑒定板上，不要超過20分鐘。如果長時間部接種到鑒定板上，一些菌會失去代謝活性。
第三步：
?? 將鑒定板編上相應的號碼。把菌懸液倒入儲液槽，不要全部倒入，因為試管底部可能有未分散的菌團。按照不同的鑒定板所需的加樣量進行移液器的程序選擇，將移液器頭安放到移液器上，必要時可以用手加固，以免造成上方漏氣。吸取菌懸液，觀察每個移液器頭中的液面是否一致，如果不一致，放出菌懸液，加固移液器頭。加完菌懸液后，蓋上蓋子。
第四步：
培養環境根據所鑒定的菌株種類而定。準備一個塑料容器，在底部鋪上濕紙巾，把鑒定板放在紙巾上，可以防止鑒定板外緣孔水分的蒸發。對于革蘭氏陰性陽性菌，鑒定板培養4-6個小時可以進行一次讀數，過夜培養（16-24個小時）可再進行一次讀數。厭氧菌在培養20-24個小時后進行一次讀數即可。酵母和絲狀真菌所需培養時間稍長，一般間隔24個小時讀一次數。
第五步：
開啟讀數儀和電腦，打開Biolog軟件，并對讀數儀進行初始化，設置好各項參數（培養時間、菌株名稱、菌株編號、菌株類型），用紙巾擦干凈培養好的鑒定板底部，放入讀數儀，A-1孔位于左上方。即可點擊“Read This”進行讀數。鑒定結果自動顯示在屏幕下方，將所得數據進行保存即可。