在real-time PCR中如何檢測DNA污染
既然把DNA叫做污染,那應該是對RNA反轉錄后進行Real-time了。
你用未進行反轉錄的RNA作為模板,跑一次檢測Real-time。如果沒有DNA污染,這次RT是不會得到擴增結果的,因為RNA不能作為普通Taq酶的模板;一旦RNA樣品里面有DNA污染,那檢測RT出現擴增產物的可能性非常高。
只要RNA作為模板的Real-time PCR得到了擴增結果,那就是存在DNA污染。
PCR產物的融解曲線必須做,而且你也必須得知道這對引物二聚體的融解峰,防止引物二聚體誤導結果。
DNA測序方法有哪些
第1 代測序技術——熒光標記的Sanger 法
第一代就不說了。
第2 代測序技術——循環陣列合成測序法
述第2 代測序技術中, 序列都是在熒光
或者化學發光物質的協助下, 通過讀取DNA 聚合酶
或DNA 連接酶將堿基連接到DNA 鏈上過程中釋放
出的光學信號而間接確定的. 除了需要昂貴的光學
監測系統, 還要記錄、存儲并分析大量的光學圖像.
這都使儀器的復雜性和成本增加. 依賴生物化學反
應讀取堿基序列更增加了試劑、耗材的使用, 在目前
測序成本中比例相當大. 直接讀取序列信息, 不使用
化學試劑, 對于進一步降低測序成本是非常可取的.
在一個正在發生突破瓶頸巨變的領域內, 很難準確
預測未來將發生什么.
第3 代測序技術——直接測序
將基因組DNA 隨機切割成大約100 kb 左右的片段,
制成單鏈并與六寡聚核苷酸探針雜交. 然后驅動結
合了探針的基因組文庫片段通過可尋址的納米孔陣
列. 通過每個孔的離子電流均可獨立測量. 追蹤電流
的變化確定探針雜交在每個基因組片段上的精確位
置. 利用基因組片段上雜交探針的重疊區域將基因
組片段文庫排列起來, 建立一組完整的基因組探針
圖. 利用計算機算法, 獲得完整的基因組序列.
如何使用簡單的實驗方法檢測DNA純度
實驗原理
DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰,蛋白質在280nm處有最大的吸收峰,鹽和小分子則集中在230nm處。因此,可以用260nm波長進行分光測定DNA濃度,OD值為1相當于大約50μg/ml雙鏈DNA。如用25px光徑,用 H2O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H2O為空白對照,根據此時讀出的OD260值即可計算出樣品稀釋前的濃度:
DNA(ug/ml)=50×OD260讀數×稀釋倍數。
RNA(ug/ml)=40×OD260讀數×稀釋倍數。
DNA/RNA純品的OD260/OD280為1.8或2.0,故根據OD260/OD280的值可以估計DNA的純度。若比值較高說明含有RNA,比值較低說明有殘余蛋白質存在。OD230/OD260的比值應在0.4-0.5之間,若比值較高說明有殘余的鹽存在.本實驗室機器顯示是OD260\OD230,則比值應在2-2.5之間,偏小則說明有殘余鹽剩余。
實驗步驟
1. 將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中[pH8.O, 1Ommo1/L的Tris緩沖液,內含〈1mmol/L EDTA〉]或懸浮溶解在滅菌水中(依據DNA含量加水)。
2. 用可掃描的紫外分光光度計測定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線,測定OD260和OD280,并計算比值:OD260/OD280,純DNA的此比值約為1.8~2.0。純RNA的此比值約為大于2.0。
3. 根據:每毫升1微克的純DNA的OD260值= 0.020,計算所得DNA的純度;
每毫升1微克的純RNA的OD260值= 0.025,計算所得RNA的純度;
并討論純度較低的原因和解決辦法。
260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景(溶液渾濁度)、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的,只看OD260/OD280(Ratio,R)。
DNA: OD260/OD280比值應接近1.80,若R值大于1.8。說明存在RNA,可重新用RNaseA處理,酚:氯仿:異戊醇(23:24:1)抽提。若R值小于1.8,則說明有蛋白質等雜質存在,需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、異戊醇重新對DNA進行純化(也可加入1/8體積的3M NaAc(pH5.2)與冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。
RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0時,認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的,不過要注意,當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時,R值可能會大于2(一般應該是<2.2的)。當R<1.8時,溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯,你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當R>2.2時,說明RNA已經水解成單核酸了。
注意事項:
1. 有用品均需要高溫高壓,以滅活殘余的DNA酶/RNA酶。
2. 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配制,RNA均用DEPC處理的水。
3. 用大口滴管或吸頭操作,以盡量減少打斷DNA的可能性。
本網站文章僅供交流學習 ,不作為商用, 版權歸屬原作者,部分文章推送時未能及時與原作者取得聯系,若來源標注錯誤或侵犯到您的權益煩請告知,我們將立即刪除.