放線正早菌作為生物活性物質的主要產生菌早已成為人們研究的焦點。然而隨著放線菌分離和分類研究的不斷深入，大量常見菌株已被反復研究，因此從中發現新化合物的幾率逐漸降低。由于新物種具有產生新的生物活性物質的潛力，人們開始使用新的方法在盡可能廣泛的范圍內尋找新的物種，特別是那些用常規方法很少分離到的稀有放線菌 (rare actinornycetes)…。2O世紀 50年代以來人們從稀有放線菌中發現了大量有價值的抗生素，如小單孢菌產生的慶大霉素，諾卡氏菌產生的利福霉素，馬杜拉放線菌產生的馬杜拉霉素和洋紅霉素，糖多孢菌產生的紅霉素，游動放線菌產生的游壁菌素，擬無枝酸菌產生的萬古霉素等等。這些事實表明稀有放線菌也具有產生新抗生素的巨大潛力ll,21。分離這些稀有放線菌，不僅可以減少對產生已知生物活性物質菌株的重復分離，還可擴展放線菌次生代謝產物的化學多樣性。

由于稀有放線菌對生長環境的特殊要求，難以用常規手段分離獲得 ，所以要根椐不同類群的特性設計針對這些特定種屬的選擇性分離方法。近年來，國內外學者在對國家自然科學基金資助項目,云南省自然科學基金重點項讓薯目.稀有放線菌選擇性分離的研究方面取得了較大進展,同時也用這些選擇性分離方法分離到不少稀有放線菌，并顯著提高了具有醫用前景的生物活性物質的發現機率。此外，這些分離方法的使用也有助于同答這樣一個問題 ：稀有放線菌很少被分離到是因為它們在環境中數量稀少，還是僅僅因為它們難以被分離和培養。本文就以上情況介紹了近年來發展起來的幾種高選擇性分離稀有放線菌的有效方法。

1 胞外多糖膠 (gellan gum)和動孢溶液 (flooding solution)相結合的分離方法

Gellan gum是由Pseudomonas elodea產生的胞外多糖，過去常用來作為植物組織培養的凝固劑，能促進植物生長。Suzuki等人 首先將其舉滑雀用于稀有放線菌的分離，并發現胞外多糖膠能促進很多放線菌的氣生菌絲生長和孢子形成.很多物質都能增加放線菌游動孢子的游動性，如蛋[j胨，牛肉膏，含土壤浸汁的磷酸鹽緩沖液，脫脂牛奶等。各種動孢溶液對不同的菌影響不同，Suzuki等在使用脫脂牛奶作為動孢溶液時發現不同的菌對脫脂牛奶的濃度、pH、處理時的溫度、離心時的速度及時間有不同的要求。另外，使用高壓滅菌后的脫脂牛奶比使用未滅菌的脫脂牛奶所獲得的游動孢子數少，這可能因刺激孢子游動性的物質對高溫高壓敏感所致l4]。

1．1 選擇性分離魚孢菌 Suzuki等曾以魚孢菌作為他們篩選生物活性物質的目標菌，對采自28個國家的466份土樣進行了分離，從 2l份土樣中分離到了魚孢菌，發現魚孢菌廣泛分布于亞洲，歐洲，大洋洲，南美洲和北美洲。他們所使用的高選擇性分離方法是l4j：200mg土樣自然風干一80℃干熱處理60min冷卻，加 2mL 0．1％脫脂牛奶 (溶于 lOmmol／[ MOPS，pH 8．0)-+27cC溫育 60rain,不時搖動以釋放游動孢子一1，000×g室溫離心 l0min一取上清液梯度稀釋后涂布 HVG平板 (0．05％腐殖酸，2mmol／L CaCI ，0．7％胞外多糖膠)，27℃培養 21～28d。HVG培養基是在 HVA培養基的基礎上改進的，與 HVA不同的是HVG含有 CaC1，并以胞外多糖膠代替瓊脂。加入適量的 CaC1 不僅使胞外多糖膠得以凝固，而且比加入 MgSO 和 MgCI 更有利于某些放線菌的氣生菌絲生長和孢子形成 。

1．2 選擇性分離游動單孢菌 玫瑰色游動單孢菌能產生孢囊霉素，這種含硫的抗生素能通過抑制芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌的蛋白合成而影響其生K。對游動單孢菌的高選擇性分離程序是_6j：500mg土樣 自然風下一l00℃干熱處理60min 冷卻，加入 2mL滅菌的 0．1％脫脂牛奶 (溶于 5mmol／L CHES，pH 9．0)

32℃溫育90rain，不時搖動以釋放游動孢子一1，000×g，室溫離心 l0min一再于32 溫育60rain一取上清液梯度稀釋后涂布于 HSG平板 (含三甲氧芐二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 lOmg／L，依諾沙星 20rng／L，氨芐青霉素鈉 2mg／L，放線酬 50mg／L，制霉菌素50 mg／L)，35℃培養 l4～21d。用這種方法對 1，200份土樣進行分離時，從 137份土樣中分離到246株游動單孢菌。并發現委內瑞拉游動單孢菌廣泛存在于從熱帶到溫帶的土壤中，但在土壤中的密度很低。HSG培養基 組成：0．05％ 腐質 酸，3mmol／L CaC12，0．000l％ FeSO4?7H2 O，0．0001％ MnC12‘4H2O，0．0001％ ZnSO4?7H2O，0．0001％ NiSO4?6H2O，5mmol／L CHES，0．7％胞外多糖膠 ，pH9．0。

1．3 選擇性分離游動雙孢菌 對游動雙孢菌 (Planobispora)的高選擇性分離程序是 ：500mg土樣 自然風干---~90％干熱處理 60min一冷卻，加人 2mL 0．1％脫脂牛奶 ，0．01％Tween80，lOOmg／L三甲氧芐二氨嘧啶，lOOmg／L萘啶酸 (溶于5mmol／I CHES,pH 9．0)---~35。【=溫育60min，不時搖動以釋放游動孢子一1，000×g，室溫離心 l0min一 取上清液梯度稀釋后涂布 HSG平板 (含三甲氧芐二氨嘧啶 50mg／L，萘啶酸 50mg／L，依諾沙星20mg／L，氨芐青霉素鈉 2m L，鏈霉素 lm L，放線酮 50mg／L，制霉菌素 50 me,／I ，pH9．0)，32oC培養 l4～21d。利用這種方法，對采 自世界各地的 1，467份土樣進行的分離中，從5l份土樣中分離到 l】9株游動雙孢菌，88％的游動雙孢菌分離于pH7．0～7．9的土樣,并發現游動雙孢菌只出現在熱帶和亞熱帶的土樣中。

2 再水化一離心法 (rehydration-centrifugation) 具游動孢子的放線菌能在干燥時形成孢子或孢子囊，而當再次濕潤時釋放出活躍的孢子。游動孢子會受到某些物質的吸引，停留下來再次繁殖。對游動孢子的分離方法很多，如使用頭發或花粉為誘餌的捕集法；以毛細管來進行的化學趨化法等。這些方法雖然也能分離到某些稀有放線菌，但要么費時費力，要么對設備和操作人員有特殊要求。最近，Hayakawa等人在 Makkar和 Cross的再水化法 基礎． 發明了再水化一離心法_9 J，分離稀有放線菌，效果顯著。操作具體程序是：取 500mg風干磨細土壤于錐形瓶中一用 50mL含 10％土壤提取液的10mmol／I 磷酸鹽緩沖液輕輕潤洗一鋁箔覆蓋，30。【=溫育 90min_÷取 8mL潤洗液，1，500×g，室溫離心20rnjn一靜置 30min~0．2mL涂布 HV瓊脂 (含三甲氧芐二氨嘧啶20mg／L，萘啶酸 10mg／L，放線酮 50mg／L)。分離平板的總菌落數隨土樣而不同，有 37％ ～86％是具游動孢子的稀有放線菌，其中以游動放線菌和指孢囊菌為主。在不同

樣品中也能分離到放線動孢菌，短鏈游動菌和動孢囊菌。上述方法經 Otoguro等人I m 改進后可高選擇性分離束絲放線菌 (Actinosynnema)。風干攪碎的樣品置研缽中按 10：1(w／w)的量加人 CaCO 粉末，混勻一鋪于玻璃纖維膜上，加無菌水使樣品濕度達 20％ (w／w)一26。【=培養 l4d_÷樣品室溫風干至恒重，置于平皿，加 50mL含 10％土壤提取液的 10mmoL／L磷酸鹽緩沖液 (pH7．0)一 30。【=浸泡 2h一取 8mI 上述溶液 1，500×g，室溫離心20rnjn一靜置 30min一取上清涂布 HV瓊脂 (含弗氏霉素40mg／L，卡那霉素 40mg／L，三甲氧芐二氨嘧啶 20mg／L，萘啶酸 10mg／L)，30。【=培養 2～3周。Otoguro等人用上述方法對 39份樣品進行分離，其中l7份樣品分離到束絲放線菌，其檢出率占總菌落數的4％ 一86％。對任意選取的29株束絲放線菌進行的抗菌試驗發現其中28株具有抗菌活性。HVA培養基 (1L)組成：腐殖酸 0．1g，CaCO3 0．02g，Na2HPO4 0．5g，MgSO4- 7H20 0．5g，KC1 1．7g，FeSO4?7H20 0．01g，核黃素0．5mg，硫胺素0．5mg，維生素B60．5mg，煙酸 0．5mg，肌醇 0．5mg，泛 酸 0．5mg，生物 素 0．25mg，對一氨基苯 甲酸0．5mg，瓊脂 18g，pH7．2。

3 極高頻輻射法 (extremely high frequency radiation) 應用極高頻輻射法 (EHF)分離稀有放線菌的機理在于 EHF能抑制一些原核生物，藻類和單細胞微生物的生長，促進某些異養和光合微生物的生長及休眠菌株的復蘇。所以采用極高頻輻射 EHF法可以選擇性地分離那些能耐受 EHF甚至受到 EHF激活的菌株。 具體過程是… ：取 100mg磨碎混勻的土樣懸浮于 lOmL無菌水中，用頻率為 1kHz的 EHF照射盛有土壤懸液的試管或平皿底部 (所使用的 EHF無熱效應)。處理方式有兩種：一種是以5．6mm或 7．1mm單一波長處理；另一種足以3．8mm～5．8mm或 8mm ～11．5mm波長連續處理。處理后州種土樣都涂布于 Gauze 2瓊脂 (含萘啶酸 10 ms／L，制霉菌素 50 ms／L)。結果顯示，以單一波長5．6mm或7．I mm處理不能選擇性分離到稀有放線菌。而以 3．8mm～5．8mm和8ram～11．5mm波長連續處理后，稀有放線菌的比例從原來的4．1％ 分別升至8．4％和30．6％。其中馬杜拉菌，小四孢菌和野野村蔭的絕對數量大為提高，

同時還能分離到那些普通方法無法分離到的菌株，如擬無枝酸芮和擬諾 氏菌。并日,分離物中具抗菌活性菌株分別增加了 13％和20％。在此基礎上 Li等人 將極高頻輻射法與連續分析相結合，能分離到單獨使用這兩種方法所不能分離到的稀有放線菌，如珊瑚狀放線菌 、原小孢菌、游動放線菌和擬孢囊菌，同時，具有抗菌活性的菌株數量增加了10％ ～20％。具體程序是：加無菌水使土樣濕度達 30％ (w／w)一撒在普通瓊脂培養基上一+第0，7，14，30，45d分別取樣進行 4．6ram～5．8ram和 8mm～1 1．5mm兩種波段的 EHF’處理(在取樣前 樣始終保持30％的濕度)_÷涂 于土壤浸汁瓊脂即可 (含 1mL／L維生素

溶液：10rag泛酸鈣，10mg尼克酸，1mg硫胺素以及微暈的生物素共同溶于 20mL水；10mg／L榮啶酸；50mg／L制霉菌素)。

4 噬菌體定向分離法 (bacteriophage) 傳統的分離方法由于對土樣的微生物多樣性等基本情況了解較少，加之放線菌生長緩慢，于是可能浪費數月的時問去分離土樣中并不存在的菌株，而當目標菌又是稀有放線菌時更是如此。基于這 ?原因，Esther等人… 設計了一種以細菌噬菌體作為指示物對環境樣品中的野野村菌 (Nonomuria)進行快速篩選和分離的新方法。首先確定土樣中是否含有能感染目標菌的噬菌體。具體步驟如下：3g土樣懸浮于 100mL PYCa液體中一28℃，250r／rain，培養 24h一培養液3，O00g離心20min一上清液經0．45 m濾膜過濾一取5 T 濾液接種于野野村菌菌苔上一28℃培養48h以上一將含有噬菌斑的瓊脂切下，用5mL PYCa洗滌一洗液經0．45Ixm濾膜過濾一點接濾液于長有野野村茼菌苔的瓊脂上以確定噬菌體是臺可以再牛。對能產生噬菌斑的土樣，采用常規的選擇性分離方法對 目標菌進行分離。結果，

放線菌l1l 20％為野野村菌。可見其并不是我們以前所認為的那樣 “稀有”。同時，我們也可以將適量的只對一種或兒種鏈霉菌有裂解作用的噬蔭體加入土樣中來減少非目標菌的數 量。

5 蔗糖梯度離心法 (sucrose-gradient centrifugation) 由于土壤中營養貧乏，放線菌大部分以孢子形式存在，網此可以利用孢子的不同特性對不同的放線菌進行選擇性分離。Karwowski 等人曾根據放線菌孢子浮力密度的差異，利用氯化銫密度梯度超速離心有效地從土壤中分離小單孢菌。最近，Yamamura 等人m 根據這一特性，運用蔗糖梯度離心選擇性地分離諾卡氏菌，也取得了成功。其方法是：在離心管中從上到下設置各 lmL的 10％、20％、30％、40％ 、50％ (w／v)的蔗糖梯度。將用無菌水稀釋為 10。土壤懸液 1mL加入到離心管上層，240×g， 室溫離心 30rain。離心后把每層蔗糖取出稀釋后涂布 0．2mL于 HV瓊脂 (含萘啶酸10mg／L，放線酮 50mg／L，金霉素 10mg／L)。結果，大部分諾卡氏菌 (Nocardia)的孢子出現在 20％的蔗糖層中，小單孢菌可以在20％和 30％蔗糖層發現，但數量較少。游動放線菌等放線菌的游動絲狀孢子只能在 10％蔗糖層出現。用這種方法對 l4份土樣進行分離時，諾卡氏菌類群的檢出率占總菌落數的5％ ～89％，而且 7l％的菌有抗菌活性。

6 結語

不斷涌現出的新型稀有放線菌分離方法將成為天然產物篩選中的有用工具 ，也使我們了解到稀有放線菌事實上廣泛存在于土壤等環境中，只是由于分離方法和手段的不完善才使得它們較少獲得。當然，除了使用特殊方法對稀有放線菌進行分離外，擴大分離范圍也是獲取稀有放線菌的一個重要手段。比如作者所在單位從 80年代初開始溫泉高溫菌的研究，發現大量新的高溫微生物資源。1991年，該所姜成林和徐麗華建

立了雙孢放線菌新屬 (Actinobispora)。近幾年，該所還從新疆 、青海樣品中發現嗜鹽放線菌新屬一個、嗜冷鏈霉菌新種一個、嗜鹽放線菌新種 6個、嗜堿放線菌新種 4個。這些材料為我們的天然產物篩選奠定了堅實的基礎。在尋找下一代化學治療劑和新的生物活性物質的過程中，放線菌特別足稀有放線菌仍然是重要的目標菌。目前，已有超過 120種抗生素由游動放線菌產生，250多種抗生素是由馬杜拉放線菌產生，到 1998年共發現有 32種生物活性物質來源于鏈孢囊菌，這些化合物都具有廣泛的化學多樣性，使得這些菌成為工業開發的重點對象。